Phomactin类二萜化合物是于1991年首次从海洋真菌Phoma sp. SANK 11486中分离鉴定出的一系列分子，作为血小板活化因子（platelet activating factor, PAF）拮抗剂，能够抑制PAF诱导的血小板聚集及其与受体的结合。PAF作为一种有效的磷脂介质，能够参与许多生理和病理过程，如炎症、过敏、心血管疾病和休克等。Phomactin作为PAF拮抗剂可以抑制PAF与其受体的结合并阻断其下游信号传导，因此具有治疗PAF介导相关疾病的潜力。
该家族化合物具有独特的双环[9.3.1]十五烷骨架，与明星分子verticillene和taxadiene有着惊人的相似之处。此外，碳骨架上还存在着多个立体选择性的氧化修饰，从而构建多个结构各异的phomactin类天然产物。藉由复杂的结构特征和潜在的成药价值，该家族天然产物备受合成化学家的关注。截至目前，围绕phomactin的化学全合成已存在多篇报道。然而，尽管已被发现32年之久，phomactin类天然产物的生物合成机制仍未被阐明。
近期，伟德BETVlCTOR1946戈惠明课题组在Angew. Chem. Int. Ed.期刊在线发表了针对活性二萜phomactin生物合成的研究。通过生物信息学分析、异源表达等手段，首次阐明phomactin类天然产物的生物合成途径。此外，利用同位素标记实验，阐明phomactatriene的重排机制，并结合蛋白晶体结构解析和定点突变实验，揭示二萜合酶PhmA新颖的金属离子结合模式和酶学机制。
Figure 1. Biosynthesis of phomactins.
通过生物信息学分析、异源表达等手段，研究者首次从phomactin的产生菌Phoma sp. ATCC 74077中鉴定出phomactin的生物合成基因簇phm。除二萜合酶（PhmA）和香叶基香叶基焦磷酸合酶（PhmB）外，phm基因簇上还编码了一个细胞色素P450单加氧酶（PhmC）、一个HMG-CoA还原酶（PhmD）、一个短链脱氢酶（PhmE）、一个转运蛋白（PhmF）和三个假设蛋白（PhmG、PhmH和PhmI）（Figure 1A）。结合体内外生化实验，证实构建多个结构各异的phomactin类天然产物仅需两个酶的参与，包括催化phomactin萜烯骨架phomactatriene（1）合成的二萜合酶PhmA，以及能够催化phomactatriene不同位点连续氧化的多功能细胞色素P450单加氧酶PhmC（Figure 1B）。
Figure 2. Cyclization mechanism of 1.
基于phomactatriene独特的双环[9.3.1]十五烷骨架，作者设计实验以阐明phomactatriene的重排机制（Figure 2）。首先，通过[2-13C]乙酸盐投喂实验，证实phomactatriene的形成过程中存在一步1,2-甲基迁移过程。随后，结合phomactatriene的结构特征，推测PhmA催化GGPP形成化合物1还需要发生两步1,2-H−迁移过程。最后，通过化学合成相应底物并表达所需蛋白，利用一锅酶法分别证实两步1,2-H−迁移过程。
Figure 3. Crystal structures of PhmA.
与经典的I型萜类合酶相比，PhmA仅具有保守的DDXXD基序，而保守的NSE/DTE基序在PhmA中缺失。此外，PhmA中RY基序相较经典的I型萜类合酶向C端移动了两个残基，据此推测其可能具有独特的酶学机制（Figure. 3C）。通过解析PhmA及其与FGGPP、Mg2+的共晶结构，并结合定点突变实验，从而证实了PhmA新颖的金属离子结合模式。除焦磷酸部分外，FGGPP的香叶基香叶基部分主要通过疏水相互作用被非极性基团协同控制。活性口袋中，需要成键的C1/C14和C10/C15的距离分别为4.3 Å和3.8 Å，有利于后续环化反应的发生（Figure. 3D）。进一步的定点突变实验表征了PhmA独特的酶促机制。
本工作首次揭示了phomactin的生物合成机制，并结合同位素标记实验、蛋白晶体结构解析和定点突变实验阐明PhmA新颖的金属离子结合模式并揭示了其独特的酶促机制。该工作为合成生物学高效生产phomactin类天然产物奠定基础，并为其它萜类天然产物的生物合成研究提供新的见解。
伟德BETVlCTOR1946博士生张丽为文章的第一作者，伟德BETVlCTOR1946戈惠明教授、张博副教授为文章的通讯作者。该研究得到了中华人民共和国科学技术部、国家自然科学基金委员会、江苏省自然科学基金委员会、中央高校基本科研业务费专项资金、BETVLCTOR伟德官网下载全球战略合作伙伴推进计划等项目的资助。
原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202312996
文章题目：Biosynthesis of Phomactin Platelet Activating Factor Antagonist Requires a Two-Enzyme Cascade